Прямые и непрямые вирусологические методы исследования. Вирусологи́ческие ме́тоды иссле́дования. "Вирусологи́ческие ме́тоды иссле́дования" в книгах

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Этиологическая диагностика вирусных заболеваний проводится вирусологическим, вирусоскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами . Три последних метода могут быть использованы как экспресс-диагностические.

Вирусологический метод диагностики.

Конечной целью метода является идентификация вирусов до вида или серологического варианта. Вирусологический метод включает несколько этапов: 1) отбор материала для исследования; 2) обработку вируссодержащего материала; 3) заражение материалом чувствительных живых систем; 4) индикацию вирусов в живых системах; 5) титрование выделенных вирусов; 6) идентификацию вирусов в иммунных реакциях.

1. Отбор материала для исследования. Проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед. При необходимости материал хранят при -20˚С. Каждый образец материала для исследования должен иметь маркировку и этикетку с указанием фамилии больного, типа материала, даты его забора, развернутый клинический диагноз и другие сведения.

В зависимости от характера заболевания, материалом для исследования могут быть: 1) смывы с носовой части глотки и мазок из глотки; 2) спинномозговая жидкость; 3) кал и ректальные мазки; 4) кровь; 5) моча; 6) жидкость из серозных полостей; 7) мазок с конъюнктивы; 8) содержимое везикул; 8) секционный материал.

Для получения смыва из ротоглотки используют 15-20 мл ВТС. Больной тщательно в течение 1 минуты полощет горло ВТС и собирает смыв в стерильный флакон.

Мазок с задней стенки глотки берут стерильным ватным тампоном, надавливая на корень языка шпателем. Тампон помещают в 2-3 мл ВТС, ополаскивают и отжимают.

Спинномозговую жидкость получают при спинномозговой пункции. 1-2 мл спинномозговой жидкости помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию.

Пробы кала отбирают в течение 2-3 дней в стерильные флаконы. Из полученного материала готовят 10 % суспензию с использованием раствора Хенкса. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, вносят в нее антибиотики и помещают в стерильную посуду.

Кровь, полученную при венепункции в объеме 5-10 мл, дефибринируют путем добавления гепарина. Цельную кровь не замораживают, антибиотики не добавляют. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают в термостате при 37˚С в течение 60 минут.

Жидкость из серозных полостей получают при их пункции в количестве 1-2 мл. Жидкость используется сразу или сохраняется в замороженном состоянии.

Мазок с конъюнктивы берут стерильным тампоном и помещают в ВТС, после чего проводят центрифугирование взятого материала и его замораживание.

Содержимое везикул отсасывают шприцем с тонкой иглой и помещают в ВТС. Материал посылается в лабораторию в виде высушенных мазков на предметных стеклах или в запаянных стерильных капиллярах или ампулах.

Секционный материал отбирают в возможно ранние сроки, соблюдая правила асептики. Для отбора каждой пробы используют отдельные наборы стерильных инструментов. Количество отбираемых тканей составляет 1-3 г, которые помещают в стерильные флаконы. Вначале берут пробы внеполостных органов (мозг, лимфатические узлы и др.). Ткани грудной полости берут до вскрытия брюшной полости. Полученные образцы тканей растирают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного раствора натрия хлорид, после чего материал центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают во флаконы, добавляют антибиотики. Материал для вирусологического исследования используется сразу или хранится при -20˚С.

2. Обработка вируссодержащего материала. Проводится с целью освобождения материала от сопутствующей бактериальной микрофлоры. Для этого используются физические и химические методы. Физические методы: 1) фильтрование через различные бактериальные фильтры; 2) центрифугирование. Химические методы: 1) обработка материала эфиром в случаях выделения вирусов, не имеющих суперкапсида; 2) добавление к материалу смеси гептана и фреона; 3) внесение антибиотиков (пенициллин – 200-300 ЕД/мл; стрептомицин – 200-500 мкг/мл; нистатин – 100-1000 ЕД/мл).

Лабораторные животные . Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.

Куриные эмбрионы . Широко доступны и просты в работе. Применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 14 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов.

Существует несколько способов заражения куриного эмбриона: в полости амниона и аллантоиса, на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок (рис. 1).

Заражение в полость аллантоиса . Куриное яйцо располагают вертикально, воздушным мешком вверх. В центре тупого полюса яйца над воздушным мешком прокалывают скорлупу, вводят иглу для внутримышечных инъекций на 2-3 мм ниже границы воздушного мешка и туберкулиновым шприцем вводят исследуемый материал. Прокол в скорлупе закрывают расплавленным парафином или лейкопластырем.

Заражение в полость амниона . Над воздушным мешком вертикально расположенного яйца прорезают окно размером 1х1 см и осторожно снимают часть хорион-аллантоисной оболочки над телом эмбриона. Пинцетом вводят в него исследуемый материал с помощью туберкулинового шприца. Амниона приводят в исходное положение, отпуская пинцет. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . Над воздушной камерой вертикально расположенного яйца вырезают кусочек скорлупы, создавая окно. Затем отслаивают оболочку под скорлупой, обнажая участок хорион-аллантоисной оболочки, на который наносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем.

Заражение в желточный мешок . Яйцо укладывают горизонтально, чтобы тело эмбриона располагалось внизу, а желток над ним. Через прокол скорлупы в области воздушного мешка вводят иглу для внутримышечных инъекций по центральной оси яйца на глубину 2/3 длины иглы и шприцем вводят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем.

После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, располагая тупым концом кверху. Температура и продолжительность инкубации зависят от биологических свойств изолируемого вируса. По окончании инкубации эмбрионы охлаждают при +4˚С 16-18 ч. После этого куриный эмбрион стерильно вскрывают, вырезая в скорлупе отверстие над воздушным мешком выше обозначенной границы. Пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают аллантоисную, затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку для изучения, остальное содержимое яйца извлекают в чашку Петри. Аллантоисная и амниотическая жидкости используются для индикации вирусов.

Культуры органов. Это правильно приготовленные срезы органов, которые in vitro сохраняют свою структуру и функции в течение нескольких дней, а иногда и недель. Культуры органов выращивают на поверхности жидкой питательной среды с помощью «плота» или «платформы». Заражение культуры органов проводят путем внесения кусочков органа или ткани в пробирку с исследуемым материалом. Адсорбцию вируса проводят в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем исследуемый материал сливают, фрагменты органа или ткани отмывают в растворе Хенкса, помещают в сосуд для культивирования, вносят питательную среду и выдерживают в термостате. Забор материала для обнаружения вируса в культуре ткани начинают со 2 дня культивирования.

Культуры клеток. Культура клеток – это популяция однотипных клеток организма животных или человека, которая выращивается в искусственных условиях и предназначается для культивирования вирусов. По длительности жизни клеточные культуры подразделяются на: 1) первичные; 2) полуперевиваемые; 3) перевиваемые.

Первичные культуры клеток получают из тканей животных и человека путём их ферментативной дезинтеграции. Кусочки ткани помещают в 0,25 % раствор трипсина при температуре 37˚С и периодически перемешивают. В результате этого происходит отделение клеток ткани друг от друга. Порции клеток собирают по мере их отделения, центрифугируют, трипсин сливают, вносят среду роста и суспендируют в ней клетки. Первичные культуры клеток могут претерпевать до 10 делений in vitro, обладают высокой чувствительностью ко многим вирусам, могут быть получены в большом количестве, безопасны в онкогенном отношении. Недостатком первичных культур является значительная трудоёмкость и длительность получения, а также возможная контаминация латентными вирусами. К первичным культурам клеток относятся клетки почки эмбриона человека, макаки резус, эмбриона свиньи, фибробласты куриных эмбрионов.

Полуперевиваемые культуры клеток представляют собой диплоидные клетки одного типа, которые способны претерпевать in vitro до 100 делений, сохраняя при этом исходный диплоидный набор хромосом. К полуперевиваемым культурам клеток относятся фибробласты эмбриона человека (рис. 2). Эти клетки чрезвычайно требовательны к условиям культивирования, поэтому в практике вирусологических лабораторий имеют ограниченное применение.

Перевиваемые культуры клеток – это однотипные опухолевые или нормальные клетки человека и животных с изменённым кариотипом, способные к неограниченному росту в условиях in vitro. Перевиваемые культуры клеток просты при культивировании, в связи с чем широко используются при лабораторной диагностике вирусных заболеваний у человека. К перевиваемым культурам клеток относятся линии НеLа (клетки карциномы шейки матки человека), КВ (клетки карциномы полости рта человека), Vero (клетки почки зеленой мартышки), СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи) и др.

Выращивание культур клеток независимо от их типа проводится в стерильных условиях в специальных плоских стеклянных сосудах – матрацах, в которые вносится питательная среда. На дне матраца клетки при своем размножении образуют монослой.

Для культивирования культур клеток используются специальные питательные среды, содержащие физиологические количества аминокислот, углеводов, минеральных солей, и имеющие рН=7,2-7,4. Наряду с питательными веществами в средах имеется индикатор, изменяющий цвет среды при сдвиге рН от оптимального значения. Наиболее широко используемыми при работе с культурами клеток являются: среда 199, среда Игла. Среда 199 включает 60 компонентов и применяется для культивирования перевиваемых и первично-трипсинизированных клеток. Среда Игла содержит минимальный набор аминокислот (13) и витаминов (8). Применяется для культивирования диплоидных и перевиваемых клеточных культур.

Выращивание клеток должно проводится в асептических условиях, в связи с чем в питательные среды вносят антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин).

4. Индикация вирусов в живых системах. Индикация вирусов – это обнаружение вирусов в исследуемом материале без установления их принадлежности к семейству, роду, виду или сероварианту.

Индикация вирусов на лабораторных животных. О присутствии вирусов в организме прежде всего свидетельствует развитие симптомов заболевания или гибель животного. У погибшего или предварительно усыпленного эфиром животного отбирают образцы пораженных органов и тканей, помещают их в фарфоровую ступку, добавляют солевой раствор и растирают с песком. Полученную суспензию центрифугируют для осаждения тканевого детрита. В надосадочной жидкости проводят индикацию вирусов по гемагглютинирующему, комплементсвязывающему или другим антигенам.

Индикация вирусов на куриных эмбрионах. В амниотической и аллантоисной жидкости индикацию вирусов осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА). При заражении куриного эмбриона на хорион-аллантоисную оболочку нередко обнаруживаются бляшки или оспины, являющиеся вирусоспецифическими повреждениями. Индикацию вирусов в хорион-аллантоисной оболочке проводят в реакциях гемагглютинации или связывания комплемента (РСК). Для этого оболочку растирают в ступке, готовят суспензию, которую центрифугируют для осаждения тканевого детрита, а надосадочную жидкость исследуют в РГА или РСК.

Индикация вирусов в культурах органов и клеток проводится по: 1) цитопатическому действию вирусов (ЦПД); 2) образованию внутриклеточных включений; 3) в реакции гемагглютинации; 4) по образованию бляшки; 5) по цветной пробе; 6) по реакции гемадсорбции.

ЦПД – это морфологические изменения в культуре органов и клеток, возникающие в процессе репродукции вирусов в клетках. Вирусы, вызывающие ЦПД, называют цитопатогенными. Характер ЦПД зависит от биологических свойств вирусов, дозы вируса, свойств клеток и условий их культивирования. ЦПД вирусов может проявляться некрозом, гроздьеобразованием, симпласто- и синцитиеобразованием, круглоклеточной дегенерацией, клеточной пролиферацией, очаговой деструкцией.

При некротическом ЦПД вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО большинство клеток полностью разрушается, оставшиеся клетки сморщены (пикноз ядра и цитоплазматической мембраны, вакуолизация), для них характерно двойное лучепреломление – сильное свечение при микроскопии.

ЦПД по типу гроздьеобразования характерно для аденовирусов, при этом клетки округляются, увеличиваются, частично сливаются между собой с образованием гроздьевидных скоплений (рис. 3).

Вирусы герпеса, кори, паротита, парагриппа, РС-вирусы вызывают ЦПД по типу симпласто- или синцитиеобразования (рис. 4).

Синцитий состоит из клеток, соединенных цитоплазматическими мостиками, тогда как симпласт – это большая многоядерная клетка, образовавшаяся в результате многократных незавершённых митозов.

ЦПД вирусов по типу круглоклеточной дегенерации характеризуется округлением клеток и утратой ими межклеточных связей. Может наблюдаться также пикноз, сморщивание и деструкция клеток (рис. 5).

У онкогенных вирусов ЦПД может проявиться трансформацией клеток в злокачественные, что сопровождается интенсивной пролиферацией клеток и образованием многослойных клеточных структур. ЦПД некоторых штаммов вирусов гриппа, осповакцины, натуральной оспы проявляется очаговой деструкцией культуры клеток – на фоне сохранившегося в целом монослоя появляются очаги поражения клеток (микробляшки).

При отсутствии или слабо выраженном ЦПД проводят заражение культуральной жидкостью новых культур клеток.

Внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре клетки образуются при репродукции в них вирусов бешенства, оспы, гриппа, герпеса, аденовирусов и др. Внутриклеточные включения представляют собой кристалловидные скопления вирионов. Включения обнаруживают при световой иммерсионной микроскопии после окраски стекол с монослоем по Романовскому-Гимзе, или при люминесцентной микроскопии после обработки акридиновым оранжевым. При окраске по Романовскому-Гимзе вирусные включения приобретают розовый или розово-сиреневый цвет. При окраске акридиновым оранжевым ДНК-структуры дают зеленое свечение, а РНК-структуры – красновато-оранжевое. В настоящее время выявление внутриклеточных включений проводят при диагностике бешенства (тельца Бабеша-Негри) (рис. 6). Ранее при натуральной оспе проводилось выявление телец Гварнери.

Образование бляшек . Бляшки – это очаги разрушенных первично инфицированных вирусом клеток монослоя, находящегося под агаровым покрытием. Бляшки выявляются путём окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учётом результатов. Поскольку бляшки состоят из погибших клеток, не воспринимающих краситель, поэтому они видны в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя живых клеток. Учёт бляшкообразования проводят для количественного анализа инфекционной активности клеток.

Цветная проба . Среды 199 и Игла, в которых культивируют культуры клеток, имеют малиновый цвет, рН=7,2-7,4 и содержат индикатор, меняющий окраску среды при изменении рН. При культивировании в этих средах клеточных культур, не инфицированных вирусом, вследствие выделения клетками кислых продуктов метаболизма цвет среды изменяется на оранжевый. Вирусинфицированные клетки в результате подавления метаболизма вирусной репродукцией, а также в результате ЦПД вирусов, разрушаются, щелочная цитоплазма клеток попадает в среду, не изменяя её цвета (среда остаётся красной).

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов, содержащих на своей внешней оболочке агглютинин, склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных. Для проведения РГА используют бесклеточный вируссодержащий материал (аллантоисную или амниотическую жидкость, супернатант тканевых культур). Вируссодержащую жидкость смешивают с 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,5 мл 1 % взвеси отмытых эритроцитов, после чего инкубируют при 37˚, 20˚ или 4˚С в течение 30-60 минут. При отрицательном контроле развитие агглютинации в опыте свидетельствует о присутствии вируса в исследуемой жидкости. Контролем служит смесь 0,5 мл эритроцитов с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида, не содержащего вирус.

Реакция гемадсорбции (РГадс) позволяет обнаружить гемагглютининсодержащие вирусы в клеточных культурах до развития ЦПД (рис. 7). Гемадсорбция наблюдается только в том случае, если гемагглютинин вируса присутствует на цитоплазматической мембране клеток культуры. Ргадс проводится путём внесения в клеточную культуру 0,2 мл 0,5 % взвеси эритроцитов, после чего клетки выдерживают 15-20 минут при 37˚, 20˚ или 4˚С (в зависимости от свойств вируса). Затем пробирки встряхивают для удаления неадсорбированных эритроцитов и учитывают под малым увеличением микроскопа скопление их на отдельных клетках или на всем монослое. На неинфицированных вирусами клетках адсорбции эритроцитов не наблюдается.

5. Титрование выделенных вирусов - это обязательный этап вирусологического метода диагностики, целью которого является количественное определение содержания вирусных частиц в единице объема исследуемого материала.

Методы титрования вирусов, выделенных на лабораторных животных предусматривают определение дозы (титра), при которой возбудитель вызывает гибель 50 % инфицированных животных или характерные симптомы заболевания. Титр вирусов выражают в ЛД 50 – летальная доза или в ИД 50 – инфицирующая доза.

Титрование вирусов, выделенных на куриных эмбрионах и обладающих гемагглютинирующей активностью проводят в реакции гемагглютинации. РГА проводят в пробирках или в специальных планшетах. Из вируссодержащего материала готовят двукратные разведения в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорид. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси эритроцитов. Контролем служит смесь 0,5 мл эритроцитов с таким же объемом изотонического раствора натрия хлорида, не содержащего вирусов. В зависимости от свойств изучаемого вируса инкубацию смеси проводят в термостате при 37˚, 20˚ и 4˚С. Результаты реакции учитывают через 30-60 минут после полного оседания эритроцитов в контроле: (++++) – интенсивная и быстрая агглютинация эритроцитов, осадок имеет звездчатую форму с фестончатыми краями («зонтик»); (+++) – осадок эритроцитов имеет просветы; (++) – менее выраженный осадок; (+) – хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов и (-) – резко очерченный осадок эритроцитов («монетный столбик»), такой же, как в контроле. Титром вируса при проведении РГА называется наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается агглютинация эритроцитов. Это разведение считают содержащим одну гемагглютинирующую единицу вируса (1 ГАЕ). Разведения, которые предшествуют 1 ГАЕ, будут содержать в 2 раза больше ГАЕ по сравнению с последующим от них разведением. Например, если 1 ГАЕ соответствует разведению 1:64, то разведение 1:32 будет соответствовать 2 ГАЕ, а разведения 1:16 и 1:8 – 4 и 8 ГАЕ соответственно. Для идентификации вирусов, как правило, используется титр вируса, равный 4 ГАЕ.

Титрование вирусов в культурах клеток проводят по ЦПД, бляшкообразованию и цветной пробе.

Титром вируса при его определении в культурах клеток по ЦПД называется то наибольшее разведение вируссодержащего материала, в котором вирус способен вызвать ЦПД у 50 % инфицированных культур клеток. Эта величина называется 50 % тканевой цитопатической дозой (ТЦД 50). Титрование вируса по ЦПД включает следующие этапы: 1) посев, выращивание и отбор пробирочных культур клеток, имеющих сформировавшийся монослой; 2) получение 10-кратных разведений вируссодержащего материала; 3) инфицирование культур клеток разными разведениями вируса; 4) выдерживание –культур клеток в термостате при 37˚; 5) учет результатов на 5-7 сутки по системе плюсов (++++) и статистическую обработку результатов. Для получения статистически достоверных результатов необходимо соблюдение ряда правил: а) использование не менее 4 пробирочных культур клеток для заражения 1 разведением вируса; б) включение в титровальный ряд 2 разведений вируса – ниже и выше ЦПД 50 .

Титрование вирусов в культурах клеток по бляшкообразованию является одним из наиболее чувствительных и точных методов количественного определения вирусов. Вместе с тем, метод технически сложен и, в основном, используется при проведении научных исследований.

Титрование вирусов в культурах клеток методом цветной пробы призвано определить наибольшее разведение вируссодержащего материала, при котором происходит изменение цвета среды, содержащей суспензию клеток в концентрации 200 тысяч клеток в 1 мл. После установления титра вируса готовят рабочую дозу – 100 ТЦД 50 , которую используют при идентификации вирусов.

6. Идентификация вирусов в иммунных реакциях. Идентификация, или титрование вирусов – это установление их вариантной, видовой, родовой и семейственной принадлежности. Идентификация вирусов проводится по принципу: определение неизвестного по известному. Известным компонентом при идентификации вирусов являются специфические противовирусные сыворотки (противогриппозные, противокоревые и др.), которые используют в серологических реакциях нейтрализации (РН), торможения гемадсорбции (РТГадс), торможения гемагглютинации (РТГА), РПГА, РСК, а также при ИФА и РИА. Эти сыворотки содержат специфические противовирусные антитела и называются диагностическими.

Реакция нейтрализации (РН) может быть проведена на культуре клеток, куриных эмбрионах и животных. В пробирках готовят нейтрализационные смеси, состоящие из равных объемов вируссодержащего материала (обычно 100 ТЦД50 вируса в 1,0 мл) и диагностической сыворотки (1,0 мл). После тщательного встряхивания приготовленные смеси выдерживают для взаимодействия в течение 3 ч при 37˚С. Затем нейтрализационные смеси вносят в чувствительную клеточную культуру, которую инкубируют при 37˚С 5-7 суток, после чего учитывают результаты по ЦПД и цветной пробе (табл. 1).

Вирусологические методы исследования - методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в е вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные - в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса а, дикого или вакцинного штамма вируса а и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его - клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект),

образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов а, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов - новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия,

а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- m -антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования ): реакции связывания комплемента,

торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую - через 2-3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген - антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций - изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. Вирусология, М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, пер. с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;

Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа - условно-патогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе - особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика - раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

1. Аллергический.

2. Микроскопический.

3. Культуральный.

4. Биологический.

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.

Вирусологические методы исследования

методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

В зараженных клеточных культурах можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его - клонированием.

Для выделения вирусов применяют восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов - новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит ткани, образуются и вирусоспецифические . Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная , а также , метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из , секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. основана на гибридизации комплементарных нитей или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую - через 2-3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары - антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций - вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Библиогр.: Букринская А.Г. , М., 1986; Вирусология, Методы, под ред. Б. Мейхи, . с англ., М., 1988; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера, М., 1982.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Вирусологические методы исследования" в других словарях:

Имеют целью обнаружение вирусов, их отождествление (идентификацию) и изучение биологических свойств. Для выделения вирусов (См. Вирусы) от человека, животных и растений исследуемый материал вводят в организм чувствительных к вирусам… … Большая советская энциклопедия

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - вирусологические исследования, комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.Основными этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование … Ветеринарный энциклопедический словарь

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. см. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важнейшим условием получения достоверных результатов исследований является правильный выбор объектов анализа, своевременный их отбор и формулировка задачи исследования. Правила отбора проб … Болезни рыб: Справочник

Учреждения системы здравоохранения либо структурные подразделения лечебно профилактических или санитарно профилактических учреждений, предназначенные для проведения различных медицинских исследований. В эту группу не входят научно… … Медицинская энциклопедия

I Эпидемиология (Эпидемия + греч. logos учение) наука, изучающая закономерности эпидемического процесса и разрабатывающая меры борьбы с заразными болезнями человека. Исторически Э. сложилась как научная дисциплина, объектом изучения которой… … Медицинская энциклопедия

I Вирусология (вирус [ы] (Вирусы) + греч. logos учение) медико биологическая наука, изучающая вирусы. Возникла в конце 19 в., когда русский ученый Д.И. Ивановский (1892) впервые установил существование мельчайших микроорганизмов, вызывающих… … Медицинская энциклопедия

- (синонимы: клещевой энцефаломиелит, весенне летний энцефалит, весенне летний менингоэнцефалит, таежный энцефалит, русский дальневосточный энцефалит) инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, интоксикацией и преимущественным поражением… … Медицинская энциклопедия

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - исследования, проводимые с целью диагностики вирусных инфекций, изучения соответствующих возбудителей, их распространения в природе, а также при производстве вирусных препаратов. В вирусологических лабораториях (см.) мед. профиля изучают как вирусы человека, так в ряде случаев и вирусы животных (напр., проводят диагностику бешенства у собак, обследование животных, используемых для производства вирусных препаратов). Методы исследования тех и других сходны.

Одним из основных этапов В. и. является выделение вирусов. При выделении вирусов от людей используют кровь, различные секреты и экскреты, кусочки органов. Наиболее часто кровь исследуют при арбовирусных заболеваниях. Используется цельная дефибринированная или Гемолизированная кровь, отдельные ее элементы или сгустки (на поздних стадиях заболевания). Вирусы бешенства, эпид, паротита, простого герпеса могут быть обнаружены в слюне. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа, кори, пситтакоза, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы также обнаруживаются аденовирусы. Смыв берут путем полоскания носа и глотки (отдельно) и промывания конъюнктивы изотоническим раствором хлорида натрия. Можно протирать носовые ходы и заднюю стенку глотки тампонами, смоченными бульоном. Нестерильный материал обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) в течение 30 мин. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено- и реовирусы. Пробы разводят 1:10 фосфатным буфером, центрифугируют дважды по 20 мин. при 8000 об I мин. Антибиотики прибавляют, как указано выше. Реже для В. и. берут содержимое пустул (при оспе, ветрянке, герпесе) и пунктаты органов (при венерической лимфогранулеме). Секционный материал следует брать как можно скорее после гибели организма. Его хранят до момента исследования при t°-20° и ниже. Для проведения В. и. ткань измельчают (растирают) и готовят 10-20% взвесь на изотоническом растворе хлорида натрия или питательной среде для клеточных культур. Ее центрифугируют 20 мин. при 1500 об/мин; надосадочную жидкость используют для дальнейшего исследования.

С целью выделения вирусов заражают лабораторных животных, эмбрионы птиц, клеточные и тканевые культуры. Животные оказываются пригодными в том случае, если вирус вызывает у них четкие клинические симптомы заболевания или патологоанатомические изменения (напр., параличи, пневмонию и т. п.). От тропизма вируса зависит эффективность того или иного пути введения материала. Широко применяют заражение под кожу, внутрибрюшинно и внутривенно. Нейротропные вирусы выявляют при заражении животных в полушария головного мозга (арбовирусы, вирус бешенства и др.), зрительный бугор (вирус полиомиелита в опытах на обезьянах), спинной мозг. Вирусы оспы и герпеса можно обнаружить путем нанесения материала кроликам на скарифицированную роговицу. Некоторые вирусы легко выявить при инокуляции в переднюю камеру глаза (напр., вирус гепатита собак в опыте на щенках). Для изучения возбудителей респираторных инфекций обычно применяют интраназальное заражение животных (закапывание материала в нос наркотизированным животным или введение его в виде аэрозоля в специальной камере). В пищеварительный тракт материал вводят с пищей или через рот тупой иглой. При изучении некоторых онкогенных вирусов применяют метод заражения золотистых хомячков в слизистую оболочку защечных мешков.

Ко многим вирусам новорожденные животные и сосунки восприимчивее половозрелых особей. Мышей-сосунков широко используют для выделения арбовирусов и вирусов Коксаки (после заражения в мозг). Некоторые аденовирусы способны индуцировать опухоли при подкожном заражении новорожденных золотистых хомячков. Изучение ряда вирусов птиц проводят на цыплятах первых дней жизни.

Использование куриных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Их недифференцированные ткани обладают широким спектром чувствительности в отношении многих вирусов. О наличии инфекции судят по гибели эмбрионов, появлению изменений (оспин) на хорион-аллантоисной оболочке (рис. 1), накоплению в эмбриональных жидкостях гемагглютининов и комплемент-связывающего вирусного антигена. Заражают эмбрионы на хорионаллантоисную оболочку (в возрасте 11 - 12 дней вирусами группы оспы), в аллантоисную и амниотическую полости (10-11-дневными миксовирусами), желточный мешок (в возрасте 5-6 дней возбудителями пситтакозаорнитоза и др.). Инокуляцию материала эмбрионам в мозг и внутривенно (в сосуды оболочек) производят редко. При любом способе заражения эмбрионы могут быть травмированы, поэтому погибших в первые 24-48 час. из учета исключают.

Для изучения действия на вирусы хим. веществ весьма удобны деэмбрионированные яйца, в которых удален эмбрион, но сохранена хорионаллантоисная оболочка. Внутрь помещают вирус и изучаемое вещество в 20 мл изотонического раствора хлорида натрия. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком с трубочкой, через к-рую можно брать пробы для анализа.

При оценке опытов на животных и эмбрионах птиц следует иметь в виду возможность провокации у них латентных инфекций или выделения находящегося в латентном состоянии вируса.

Исключительно широко для выделения и накопления вирусов применяют культуры клеток и тканей (см.). Этими методами можно культивировать большинство известных вирусов (см. Культивирование вирусов). Некоторые из них интенсивно накапливаются уже при первичном заражении культур, для адаптации других требуется несколько пассажей. Размножение большинства вирусов в клеточных культурах сопровождается развитием цитопатического эффекта. По его характеру в известной степени можно судить о принадлежности вирусов к тому или иному роду: пикорнавирусы вызывают округление и сморщивание клеток, аденовирусы - образование округлившимися клетками скоплений в виде виноградных гроздьев, миксовирусы и герпетические вирусы - формирование многоядерных синцитиев. Ряд вирусов культивировать вне организма не удается.

Размножение некоторых вирусов (оспенная группа, миксо- и арбовирусы) можно обнаружить с помощью реакции гемадсорбции, поскольку пораженные клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты. Соответствующие эритроциты (человека, обезьяны, морской свинки, курицы) в концентрации 0,4-0,5% помещают на монослой при t° 4° или при комнатной температуре на 20- 30 мин. Эритроциты адсорбируются диффузно по всей культуре (напр., парагриппозными вирусами) или формируют островки (вирусы гриппа, паротита).

О размножении вируса иногда судят путем исследования культуральной жидкости на животных (клещевой энцефалит) или в РСК. Наличие вируса, не обладающего цитопатической активностью, иногда определяют по его способности интерферировать с цитопатогенным вирусом. Так, в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкозов птиц, подавляется размножение вируса саркомы Рауса. Для обнаружения нецитопатогенных штаммов вирусов диареи крупного рогатого скота и холеры свиней предложен метод END (exaltation of Newcastle disease virus) - суперинфицирование культур вирусом болезни Ньюкасла. При совместном действии обоих вирусов наступает разрушение клеток.

При появлении цитопатических изменений или других признаков размножения вируса культуральную жидкость используют для идентификации вируса или пассажа. Ряд вирусов остается связанным с клетками даже при дегенерации культуры (аденовирусы, вирусы группы оспы), вследствие чего производят замораживание и оттаивание культур перед сбором жидкости. Некоторые герпетические вирусы, напр, вирус болезни Марека у кур, необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками.

Для изучения респираторных корона-вирусов человека и некоторых других используют метод тканевых культур, т. е. заражение культивируемых in vitro тканевых фрагментов. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. Размножающийся вирус поражает клетки эндотелия слизистой оболочки, что определяют по прекращению движения ресничек.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах тканей и клеток посторонних вирусов. Они могут быть внесены с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или сыворотки, использованной для культивирования клеток.

Помимо посева биопсийного или секционного материала на уже выращенные культуры, применяют непосредственное культивирование клеток исследуемого органа после его трипсинизации, что нередко более эффективно в отношении выделения вируса (напр., обнаружение аденовирусов в миндалинах). Используют также методику смешанных культур, когда клетки исследуемого органа выращивают вместе с какими-либо чувствительными к данному вирусу клетками (напр., посев клеток мозга больных подострым склерозирующим панэнцефалитом вместе с клетками почек обезьян или Hela-клетками для выделения вируса кори). Метод смешанных культур является зачастую единственным способом выделения вируса из индуцированных им у животных опухолей, которые не продуцируют активного вируса, однако содержат вирусный геном.

Однослойные клеточные культуры дают возможность получить колонии вируса - бляшки (рис. 2). Как правило, бляшки формируют вирусы, обладающие цитопатической активностью. В то же время этот метод позволяет обнаруживать некоторые нецитопатогенные вирусы (напр., ряд штаммов вируса диареи крупного рогатого скота). Для получения бляшек вирус вносят на клеточный монослой в чашках или плоских флаконах. Множественность заражения, т. е. число вирусных частиц на одну клетку, должна быть небольшой, чтобы образовавшиеся бляшки не сливались. После 30-60 мин. адсорбции наслаивают питательную среду с 1,35 - 1,5% агара и нейтральным красным в конечном разведении 1: 40 000. Культуры в чашках Петри инкубируют в атмосфере с 5-10% углекислоты, а герметически закрытые флаконы - в обычном термостате. Через несколько дней среди прижизненно окрашенных клеток начинают выделяться неокрашенные фокусы из дегенерированных клеток.

Можно на клетки помещать агар без нейтрального красного, а через несколько дней нанести второй слой агара с красителем; бляшки становятся видимыми через несколько часов. Агар иногда содержит сульфаты полисахаридов, которые являются ингибиторами роста вирусов; для их нейтрализации в среду добавляют протамин-сульфат (60 мг на 100 мл). Для получения бляшек ряда вирусов можно использовать в качестве покрытия метилцеллюлозу и другие вещества. Некоторые вирусы (оспы, кори) формируют бляшки и без агарового покрытия. Метод бляшек позволяет провести клональный анализ вирусных штаммов. Для выделения генетически однородных клонов извлекают одну бляшку, к-рую используют для следующего заражения. Обычно клонирование проводят на протяжении трех пассажей.

Метод бляшек пригоден также для определения в зараженной культуре количества клеток, продуцирующих вирус (т. е. число инфекционных центров). Для этого клетки суспендируют, помещают на однослойную культуру чувствительных к вирусу индикаторных клеток и заливают агаром. Вокруг зараженных клеток формируются бляшки.

Для диагностики вирусных инфекций и изучения антигенной структуры вирусов применяется реакция преципитации в геле. Чаще всего с этой целью используют агар. Антигены и специфические антитела, помещенные в агаровый гель на определенном расстоянии, диффундируют и образуют при встрече преципитат в виде белых полос. 0,8-1% агар в изотоническом растворе хлорида натрия или фосфатном буфере помещают в капилляры или наносят слоем на предметные стекла. Антигены предпочтительно иметь очищенные и концентрированные. Ингредиенты реакции вносят на агар в противоположные концы капилляра или в лунки, сделанные в слое агара на стеклах на расстоянии 5-6 мм. Инкубация продолжается 4-20 час.

Значительное число В. и. выполняют с помощью световой и электронной микроскопии. Наиболее крупные вирусы (напр., оспы) после соответствующей обработки (серебрение, окраска викторияблау и др.) могут быть выявлены при обычной световой микроскопии. Этот метод применяют при диагностике оспы путем обследования материала из пустул. Характерным для некоторых инфекций является формирование в клетках телец - включений. Так, в ядрах появляются включения при герпетической и аденовирусной инфекции, в цитоплазме - при оспе (тельца Гуарниери) и бешенстве (тельца Бабеша- Негри). Обнаружение включений имеет значение для диагностики бешенства, оспы, цитомегалии, подострого склерозирующее панэнцефалита и др.

Микроскопию в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) и фазово-контрастную микроскопию (см.) используют гл. обр. для изучения динамики изменений в пораженных вирусом клетках. Более широко применяют люминесцентную микроскопию (см.).

Исследуют мазки, отпечатки и выращенные на стеклах однослойные клеточные культуры. Препараты (нативные или фиксированные) чаще всего окрашивают акридином оранжевым. Метод позволяет выявлять крупные вирусы и скопления вирусных компонентов. Образования, содержащие ДНК, светятся ярко-зеленым светом, а содержащие РНК - кирпично-красным. Еще чаще при В. и. производят обработку зараженных клеток флюоресцирующими антителами, что позволяет выявить скопления вирусного антигена. При прямом методе используют иммунный гамма-глобулин, меченный флюоресцентным красителем, напр, флюоресцеин-изотиоцианатом. При непрямом методе препарат обрабатывают обычной иммунной сывороткой какого-либо животного, а затем мечеными антителами против гамма-глобулина этого животного. Препараты просматривают в ультрафиолетовом свете, вирусный антиген обнаруживают по светло-зеленому свечению (см. Иммунофлюоресценция). Метод мазков из носоглотки позволяет проводить раннюю диагностику респираторных вирусных инфекций - гриппозной, парагриппозной, рино- и аденовирусной, респираторно-синцитиальной.

Хим. состав вирусов исследуют общепринятыми хим. методами. Нуклеиновую к-ту обычно получают фенольной экстракцией, реже применяют анионные детергенты - додецил- или лаурилсульфат натрия.

Для идентификации вирусов (см.) в первую очередь следует установить их родовую принадлежность. Для этого необходимо определить размеры и структуру вирусных частиц, вид входящей в их состав нуклеиновой к-ты, наличие липоидной оболочки. Вид нуклеиновой к-ты чаще всего определяют косвенными методами, напр, используя способность бромдезоксиуридина подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов. Наличие липоидной оболочки у вируса устанавливают по его чувствительности к действию эфира и хлороформа (имеющие оболочку вирусы инактивируются). Дальнейшую идентификацию проводят с набором иммунных сывороток к известным вирусам, используя различные реакции - нейтрализации, РСК, РТГА и др. Реже производят иммунизацию животных известным вирусом с дальнейшим их заражением неизвестным или наоборот.

Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.; Лурия G. Е. и Д а р н e л л Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; П ш e н и ч-н о в В. А., Семенов Б.Ф. иЗезе-р о в Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.