Многочисленные спектроскопические методы, появившиеся во второй половине XX века, - электронная и атомно-силовая микроскопии, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрия - казалось бы, давно отправили традиционную оптическую микроскопию «на пенсию». Однако умелое использование явления флуоресценции не раз продляло «ветерану» жизнь. В этой статье речь пойдет про квантовые точки (флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы), вдохнувшие в оптическую микроскопию новые силы и позволившие заглянуть за пресловутый дифракционный предел. Уникальные физические свойства квантовых точек делают их идеальным средством для сверхчувствительной многоцветной регистрации биологических объектов, а также для медицинской диагностики.
В работе даются представления о физических принципах, определяющих уникальные свойства квантовых точек, основных идеях и перспективах использования нанокристаллов и рассказывается об уже достигнутых успехах их применения в биологии и медицине. Статья основана на результатах исследований, проводимых в последние годы в Лаборатории молекулярной биофизики Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова совместно с Реймским Университетом и Белорусским Государственным Университетом, направленных на развитие технологии биомаркеров нового поколения для различных областей клинической диагностики, включая раковые и аутоиммунные заболевания, а также на создание новых типов наносенсоров для одновременной регистрации многих биомедицинских параметров. Первоначальная версия работы была опубликована в «Природе» ; до некоторой степени статья основана на втором семинаре Совета молодых ученых ИБХ РАН . - Ред.
Часть I, теоретическая
Рисунок 1. Дискретные уровни энергии в нанокристаллах. «Сплошной» полупроводник (слева ) имеет валентную зону и зону проводимости, разделенные запрещенной зоной E g . Нанокристалл из полупроводника (справа ) характеризуется дискретными уровнями энергии, подобными уровням энергии одиночного атома. В нанокристалле E g является функцией размера: увеличение размера нанокристалла ведет к уменьшению E g .
Уменьшение размера частицы приводит к проявлению весьма необычных свойств материала, из которого она сделана. Причиной этого являются квантово-механические эффекты, возникающие при пространственном ограничении движения носителей заряда: энергия носителей в этом случае становится дискретной. А число уровней энергии, как учит квантовая механика, зависит от размера «потенциальной ямы», высоты потенциального барьера и массы носителя заряда. Увеличение размера «ямы» ведет к росту числа уровней энергии, которые при этом становятся все ближе друг к другу, пока не сольются, и энергетический спектр не станет «сплошным» (рис. 1). Ограничить движение носителей заряда можно по одной координате (формируя квантовые пленки), по двум координатам (квантовые проволоки или нити) или по всем трем направлениям - это будут квантовые точки (КТ).
Полупроводниковые нанокристаллы являются промежуточными структурами между молекулярными кластерами и «сплошными» материалами. Границы между молекулярными, нанокристаллическими и сплошными материалами не определены с достаточной четкостью; однако диапазон 100 ÷ 10 000 атомов на частицу можно ориентировочно считать «верхним пределом» нанокристаллов. Верхний предел соответствует размерам, для которых интервал между уровнями энергии превышает энергию тепловых колебаний kT (k - постоянная Больцмана, T - температура), когда носители заряда становятся мобильными.
Естественный масштаб длины для электронных возбужденных областей в «непрерывных» полупроводниках определяется радиусом экситона Бора a x , который зависит от силы Кулоновского взаимодействия между электроном (e ) и дыркой (h ). В нанокристаллах же величиной порядка a x сам размер начинает влиять на конфигурацию пары e–h и, следовательно, размер экситона. Получается, что в этом случае электронные энергии непосредственно определяются размером нанокристалла - это явление известно как «эффект квантового ограничения». Используя этот эффект, можно регулировать ширину запрещенной зоны нанокристалла (E g ), просто изменяя размер частицы (таблица 1).
Уникальные свойства квантовых точек
Как физический объект квантовые точки известны довольно давно, являясь одной из интенсивно развиваемых сегодня форм гетероструктур . Особенностью квантовых точек в форме коллоидных нанокристаллов является то, что каждая точка - это изолированный и мобильный объект, находящийся в растворителе. Такие нанокристаллы можно использовать для построения различных ассоциатов, гибридов, упорядоченных слоев и т.п., на основе которых конструируют элементы электронных и оптоэлектронных устройств, пробники и сенсоры для анализов в микрообъемах вещества, различные флуоресцентные, хемилюминесцентные и фотоэлектрохимические наноразмерные датчики.
Причиной стремительного проникновения полупроводниковых нанокристаллов в разнообразные области науки и технологии являются их уникальные оптические характеристики , :
- узкий симметричный пик флуоресценции (в отличие от органических красителей, для которых характерно наличие длинноволнового «хвоста»; рис. 2, слева ), положение которого регулируется выбором размера нанокристалла и его составом (рис. 3);
- широкая полоса возбуждения, что позволяет возбуждать нанокристаллы разных цветов одним источником излучения (рис. 2, слева ). Это достоинство принципиально при создании систем многоцветного кодирования;
- высокая яркость флуоресценции, определяемая высоким значением экстинкции и высоким квантовым выходом (для нанокристаллов CdSe/ZnS - до 70%);
- уникально высокая фотостабильность (рис. 2, справа ), что позволяет использовать источники возбуждения высокой мощности.
Рисунок 2. Спектральные свойства кадмий-селеновых (CdSe) квантовых точек. Слева: Нанокристаллы разных цветов можно возбудить одним источником (стрелкой показано возбуждение аргоновым лазером с длиной волны 488 нм). На врезке - флуоресценция CdSe/ZnS нанокристаллов разных размеров (и, соответственно, цветов), возбуждаемых одним источником света (УФ-лампа). Справа: Квантовые точки чрезвычайно фотостабильны по сравнению с другими распространенными красителями, быстро разрушающимися под лучом ртутной лампы во флуоресцентном микроскопе.
Рисунок 3. Свойства квантовых точек из разных материалов. Сверху: Диапазоны флуоресценции нанокристаллов, изготовленных из разных материалов. Снизу: CdSe квантовые точки разных размеров покрывают весь видимый диапазон 460–660 нм. Снизу справа: Схема стабилизированной квантовой точки, где «ядро» покрыто оболочкой из полупроводника и защитным слоем полимера.
Технология получения
Синтез нанокристаллов осуществляется быстрой инъекцией соединений-предшественников в реакционную среду при высокой температуре (300–350 °С) и последующим медленным ростом нанокристаллов при относительно низкой температуре (250–300 °С). В «фокусирующем» режиме синтеза скорость роста маленьких частиц больше скорости роста больших, в результате чего разброс по размерам нанокристаллов уменьшается , .
Технология контролируемого синтеза позволяет управлять формой наночастиц, используя анизотропию нанокристаллов. Характерная кристаллическая структура конкретного материала (например, для CdSe характерна гексагональная упаковка - вурцит, рис. 3) опосредует «выделенные» направления роста, определяющие форму нанокристаллов. Так получают наностержни или тетраподы - нанокристаллы, вытянутые в четырех направлениях (рис. 4) .
Рисунок 4. Разная форма CdSe нанокристаллов. Слева: CdSe/ZnS нанокристаллы сферической формы (квантовые точки); в центре: стержневидной формы (квантовые стержни). Справа: в форме тетраподов. (Просвечивающая электронная микроскопия. Метка - 20 нм.)
Преграды на пути практического применения
На пути практического применения нанокристаллов из полупроводников групп II–VI стоит ряд ограничений. Во-первых, квантовый выход люминесценции у них существенно зависит от свойств окружающей среды. Во-вторых, стабильность «ядер» нанокристаллов в водных растворах также невелика. Проблема заключается в поверхностных «дефектах», играющих роль безызлучательных центров рекомбинации или «ловушек» для возбужденных e–h пар.
Для преодоления этих проблем квантовые точки заключают в оболочку, состоящую из нескольких слоев широкозонного материала. Это позволяет изолировать e-h пару в ядре, увеличить время ее жизни, уменьшать безызлучательную рекомбинацию, а значит - увеличить квантовый выход флуоресценции и фотостабильность.
В связи с этим, к настоящему времени наиболее широко используемые флуоресцентные нанокристаллы имеют структуру ядро/оболочка (рис. 3). Развитые процедуры синтеза CdSe/ZnS нанокристаллов позволяют достичь квантового выхода 90%, что близко к лучшим органическим флуоресцентным красителям.
Часть II: применение квантовых точек в форме коллоидных нанокристаллов
Флуорофоры в медицине и биологии
Уникальные свойства КТ позволяют использовать их практически во всех системах мечения и визуализации биологических объектов (за исключением только флуоресцентных внутриклеточных меток, экспрессируемых генетически - широко известных флуоресцентных белков ).
Для визуализации биологических объектов или процессов КТ можно вводить в объект непосредственно или с «пришитыми» распознающими молекулами (обычно это антитела или олигонуклеотиды). Нанокристаллы проникают и распределяются по объекту в соответствии со своими свойствами. Например, нанокристаллы разных размеров по-разному проникают сквозь биологические мембраны, а поскольку размер определяет цвет флуоресценции, разные области объекта оказываются окрашенными также по-разному (рис. 5) , . Наличие распознающих молекул на поверхности нанокристаллов позволяет реализовать адресное связывание: нужный объект (например, опухолевый) окрашивается заданным цветом !
Рисунок 5. Окрашивание объектов. Слева: многоцветное конфокальное флуоресцентное изображение распределения квантовых точек на фоне микроструктуры клеточного цитоскелета и ядра в клетках линии THP-1 фагоцитов человека. Нанокристаллы остаются фотостабильными в клетках в течение как минимум 24 часов и не вызывают нарушений структуры и функции клеток. Справа: накопление нанокристаллов, «сшитых» с пептидом RGD в опухолевой области (стрелка). Правее - контроль, введены нанокристаллы без пептида (CdTe нанокристаллы, 705 нм).
Спектральное кодирование и «жидкие микрочипы»
Как уже указывалось, пик флуоресценции нанокристаллов узок и симметричен, что позволяет надежно выделять сигнал флуоресценции нанокристаллов разных цветов (до десяти цветов в видимом диапазоне). Наоборот, полоса поглощения нанокристаллов широкая, то есть нанокристаллы всех цветов можно возбуждать единым источником света. Эти свойства, а также их высокая фотостабильность, делают квантовые точки идеальными флуорофорами для многоцветного спектрального кодирования объектов - подобно штрих-коду, но с использованием многоцветности и «невидимых» кодов, флуоресцирующих в инфракрасной области.
В настоящее время все шире используется термин «жидкие микрочипы», позволяющие, подобно классическим плоским чипам, где детектирующие элементы расположены на плоскости, проводить анализ по множеству параметров одновременно, используя микрообъемы пробы. Принцип спектрального кодирования с использованием жидких микрочипов иллюстрирует рисунок 6. Каждый элемент микрочипа содержит заданные количества КТ определенных цветов, и число кодируемых вариантов при этом может быть очень велико!
Рисунок 6. Принцип спектрального кодирования. Слева: «обычный» плоский микрочип . Справа: «жидкий микрочип», каждый элемент которого содержит заданные количества КТ определенных цветов. При n уровнях интенсивности флуоресценции и m цветах теоретическое количество кодируемых вариантов равно n m −1. Так, для 5–6 цветов и 6 уровней интенсивности это будет 10000–40000 вариантов.
Такие кодированные микроэлементы могут применяться для прямого мечения любых объектов (например, ценных бумаг). Будучи внедренными в полимерные матрицы, они чрезвычайно устойчивы и долговечны. Другой аспект применения - идентификация биологических объектов при развитии методов ранней диагностики. Метод индикации и идентификации заключается в том, что к каждому спектрально кодированному элементу микрочипа присоединяется определенная распознающая молекула , . В растворе присутствует вторая распознающая молекула, к которой «пришит» сигнальный флуорофор. Одновременное появление флуоресценции микрочипа и сигнального флуорофора свидетельствует о присутствии в анализируемой смеси изучаемого объекта.
Для анализа кодированных микрочастиц «на потоке» может использоваться проточная цитометрия. Раствор, содержащий микрочастицы, проходит через облучаемый лазером канал, где каждая частица характеризуется спектрально. Программное обеспечение прибора позволяет выявить и охарактеризовать события, связанные с появление в пробе определенных соединений - например, маркеров раковых или аутоиммунных заболеваний , .
В будущем на основе полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов могут быть созданы микроанализаторы для одновременной регистрации сразу огромного числа объектов.
Молекулярные сенсоры
Использование КТ в качестве зондов позволяет измерять параметры среды в локальных областях, размер которых сравним с размерами зонда (нанометровая шкала). В основу действия таких измерительных инструментов положено использование эффекта Ферстеровского безызлучательного резонансного переноса энергии (Förster resonanse energy transfer - FRET ). Суть эффекта FRET заключается в том, что при сближении двух объектов (донора и акцептора) и перекрытии спектра флуоресценции первого со спектром поглощения второго, энергия передается безызлучательно - и, если акцептор может флуоресцировать, он засветится с удвоенной силой.
Об эффекте FRET мы уже писали в статье «Рулетка для спектроскописта » .
Три параметра квантовых точек делают их весьма привлекательными донорами в системах с FRET-форматом.
- Возможность с высокой точностью подбирать длину волны эмиссии для получения максимального перекрытия спектров эмиссии донора и возбуждения акцептора.
- Возможность возбуждения разных КТ одной длиной волны одного источника света.
- Возможность возбуждения в спектральной области, далекой от длины волны эмиссии (разница >100 нм).
Есть две стратегии использования эффекта FRET:
- регистрация акта взаимодействия двух молекул за счет конформационных изменений в системе донор-акцептор и
- регистрация изменений оптических свойств донора или акцептора (например, спектра поглощения).
Такой подход позволил реализовать наноразмерные сенсоры для измерения рН и концентрации ионов металлов в локальной области образца. Чувствительным элементом в таком сенсоре является слой индикаторных молекул, изменяющих оптические свойства при связывании с регистрируемым ионом. В результате связывания перекрытие спектров флуоресценции КТ и поглощения индикатора изменяется, что меняет и эффективность передачи энергии.
Подход, использующий конформационные изменения в системе донор-акцептор, реализован в наноразмерном сенсоре температуры. Действие сенсора основано на температурном изменении формы молекулы полимера, связывающей квантовую точку и акцептор - тушитель флуоресценции. При изменении температуры меняется и расстояние между тушителем и флуорофом, и интенсивность флуоресценции, по которой уже делают вывод о температуре.
Молекулярная диагностика
Разрыв или формирование связи между донором и акцептором можно зарегистрировать точно так же. Рисунок 7 демонстрирует «сэндвичевый» принцип регистрации, при котором регистрируемый объект выступает в качестве связующего звена («адаптера») между донором и акцептором.
Рисунок 7. Принцип регистрации с использованием FRET-формата. Формирование конъюгата («жидкий микрочип»)-(регистрируемый объект)-(сигнальный флуорофор) приводит к сближению донора (нанокристалл) с акцептором (краситель AlexaFluor). Само по себе лазерное излучение не возбуждает флуоресценцию красителя; флуоресцентный сигнал появляется только за счет резонансного переноса энергии от CdSe/ZnS нанокристалла. Слева: структура конъюгата с переносом энергии. Справа: спектральная схема возбуждения красителя.
Примером реализации этого метода является создание диагностикума на аутоиммунное заболевание системная склеродермия (склеродерма) . Здесь донором послужили квантовые точки с длиной волны флуоресценции 590 нм, а акцептором - органический краситель - AlexaFluor 633. На поверхность микрочастицы, содержащей квантовые точки, «пришили» антиген к аутоантителу - маркеру склеродермы. В раствор вводили вторичные антитела, помеченные красителем. В отсутствии мишени краситель не сближается с поверхностью микрочастицы, перенос энергии отсутствует и краситель не флуоресцирует. Но если в пробе появляются аутоантитела, это приводит к образованию комплекса микрочастица-аутоантитело-краситель. В результате переноса энергии краситель возбуждается, и в спектре появляется сигнал его флуоресценции с длиной волны 633 нм.
Важность этой работы еще и в том, что аутоантитела могут использоваться как диагностические маркеры на самой ранней стадии развития аутоиммунных заболеваний. «Жидкие микрочипы» позволяют создавать тест-системы, в которых антигены находятся в гораздо более естественных условиях, нежели на плоскости (как в «обычных» микрочипах). Уже полученные результаты открывают путь к созданию нового типа клинических диагностических тестов, основанных на использовании квантовых точек. А реализация подходов, основанных на использовании спектрально кодированных жидких микрочипов, позволит одновременно определять содержание сразу множества маркеров, что является основой существенного повышения достоверности результатов диагностики и развития методов ранней диагностики.
Гибридные молекулярные устройства
Возможность гибкого управления спектральными характеристиками квантовых точек открывает путь к наноразмерным спектральным устройствам. В частности, КТ на основе кадмий-теллура (CdTe) позволили расширить спектральную чувствительность бактериородопсина (бР), известного своей способностью использовать световую энергию для «перекачки» протонов через мембрану. (Получающийся электрохимический градиент используется бактериями для синтеза АТФ.)
Фактически, был получен новый гибридный материал: присоединение квантовых точек к пурпурной мембране - липидной мембране, содержащей плотно упакованные молекулы бактериородопсина, - расширяет диапазон фоточувствительности до УФ- и синей областей спектра, где «обычный» бР не поглощает свет (рис. 8) . Механизм передачи энергии бактериородопсину от квантовой точки, поглощающей свет в УФ- и синей областях, все тот же: это FRET; акцептором излучения в этом случае выступает ретиналь - тот же самый пигмент, который работает в фоторецепторе родопсине .
Рисунок 8. «Апгрейд» бактериородопсина с помощью квантовых точек. Слева: протеолипосома, содержащая бактериородопсин (в форме тримеров) с «пришитыми» к нему квантовыми точками на основе CdTe (показаны оранжевыми сферами). Справа : схема расширения спектральной чувствительности бР за счет КТ: на спектре область поглощения КТ находится в УФ- и синей частях спектра; спектр испускания можно «настроить», подобрав размер нанокристалла. Однако в этой системе испускания энергии квантовыми точками не происходит: энергия безызлучательно мигрирует на бактериородопсин, который совершает работу (закачивает ионы H + внутрь липосомы).
Созданные на основе такого материала протеолипосомы (липидные «пузырьки», содержащие гибрид бР-КТ) при освещении закачивают внутрь себя протоны, эффективно понижая pH (рис. 8). Это незначительное на первый взгляд изобретение может лечь в будущем в основу оптоэлектронных и фотонных устройств и найти применение в сфере электроэнергетики и других видах фотоэлектрических преобразований.
Резюмируя, следует подчеркнуть, что квантовые точки в форме коллоидных нанокристаллов являются перспективнейшими объектами нано-, бионано- и биомеднанотехнологий. После первой демонстрации возможностей квантовых точек в качестве флуорофоров в 1998 году в течение нескольких лет наблюдалось затишье, связанное с формированием новых оригинальных подходов к использованию нанокристаллов и реализации тех потенциальных возможностей, которыми обладают эти уникальные объекты. Но в последние годы наметился резкий подъем: накопление идей и их реализаций определили прорыв в области создания новых устройств и инструментов, основанных на применении полупроводниковых нанокристаллических квантовых точек в биологии, медицине, электронной технике, технологии использования солнечной энергии и многих других. Конечно на этом пути еще много нерешенных проблем, но растущий интерес, растущее число коллективов, которые работают над этими проблемами, растущее число публикаций, посвященных этому направлению, позволяют надеяться, что квантовые точки станут основой техники и технологий следующего поколения.
Видеозапись выступления В.А. Олейникова на втором семинаре Совета молодых ученых ИБХ РАН, прошедшем 17 мая 2012 года.
Литература
- Олейников В.А. (2010). Квантовые точки в биологии и медицине . Природа . 3 , 22;
- Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.Р. (2007). Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине . Российские нанотехнологии . 2 , 160–173;
- Alyona Sukhanova, Lydie Venteo, Jérôme Devy, Mikhail Artemyev, Vladimir Oleinikov, et. al.. (2002). Highly Stable Fluorescent Nanocrystals as a Novel Class of Labels for Immunohistochemical Analysis of Paraffin-Embedded Tissue Sections . Lab Invest . 82 , 1259-1261;
- C. B. Murray, D. J. Norris, M. G. Bawendi. (1993). Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E = sulfur, selenium, tellurium) semiconductor nanocrystallites . J. Am. Chem. Soc. . 115 , 8706-8715;
- Margaret A. Hines, Philippe Guyot-Sionnest. (1998). Bright UV-Blue Luminescent Colloidal ZnSe Nanocrystals . J. Phys. Chem. B . 102 , 3655-3657;
- Manna L., Scher E.C., Alivisatos P.A. (2002). Shape control of colloidal semiconductor nanocrystals . J. Clust. Sci. 13 , 521–532;
- Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии ;
- Igor Nabiev, Siobhan Mitchell, Anthony Davies, Yvonne Williams, Dermot Kelleher, et. al.. (2007). Nonfunctionalized Nanocrystals Can Exploit a Cell"s Active Transport Machinery Delivering Them to Specific Nuclear and Cytoplasmic Compartments . Nano Lett. . 7 , 3452-3461;
- Yvonne Williams, Alyona Sukhanova, MaÅgorzata Nowostawska, Anthony M. Davies, Siobhan Mitchell, et. al.. (2009). Probing Cell-Type-Specific Intracellular Nanoscale Barriers Using Size-Tuned Quantum Dots Нано-pH-метр ;
- Alyona Sukhanova, Andrei S. Susha, Alpan Bek, Sergiy Mayilo, Andrey L. Rogach, et. al.. (2007). Nanocrystal-Encoded Fluorescent Microbeads for Proteomics: Antibody Profiling and Diagnostics of Autoimmune Diseases . Nano Lett. . 7 , 2322-2327;
- Aliaksandra Rakovich, Alyona Sukhanova, Nicolas Bouchonville, Evgeniy Lukashev, Vladimir Oleinikov, et. al.. (2010). Resonance Energy Transfer Improves the Biological Function of Bacteriorhodopsin within a Hybrid Material Built from Purple Membranes and Semiconductor Quantum Dots . Nano Lett. . 10 , 2640-2648;
«Нанотехнологии» - слово со сложной историей и контекстом в русском языке, к сожалению, слегка дискредитированное. Однако если отвлечься от ироничного общественно-экономического подтекста, то можно констатировать, что нанотехнологии за последние годы из научно-теоретического концепта стали обретать формы, которые в обозримом будущем могут стать реальными коммерческими продуктами и войти в нашу жизнь.
Отличный пример тому – квантовые точки. Технологии с использованием наночастиц полупроводников постепенно находят себе применения в совершенно различных областях: медицина, полиграфия, фотовольтаика, электроника – некоторые из продуктов еще существуют на уровне прототипов, где-то технология реализована частично, а какие-то уже практически используются.
Так что такое «квантовая точка» и «с чем ее едят»?
Квантовая точка – это нанокристал неорганического полупроводникового материала (кремния, фосфида индия, селенида кадмия). «Нано» - значит измеряющийся в миллиардных долях, размеры таких кристаллов варьируются в пределах от 2 до 10 нанометров. Из-за такого малого размера электроны в наночастицах ведут себя совсем не так как в объемных полупроводниках.
Энергетический спектр квантовой точки неоднороден, в нем есть отдельные уровни энергии для электрона (отрицательно заряженной частицы) и дырки. Дыркой в полупроводниках называется незаполненная валентная связь, носитель положительного заряда численно равному электрону, она появляется, когда связь между ядром и электроном разрывается.
Если создаются условия, при которых носитель заряда в кристалле переходит с уровня на уровень, то при этом переходе излучается фотон. Изменяя размер частицы можно управлять частотой поглощения и длиной волны этого излучения. Практически же это значит, что в зависимости от размера частицы точки при облучении они будут светиться разным цветом.
Возможность контролировать длину волны излучения через размер частицы позволяет получать из квантовых точек устойчивые вещества, превращающие поглощаемую ими энергию в световое излучение – фотостабильные люминофоры.
Растворы на основе квантовых точек превосходят традиционные органические и неорганические люминофоры по ряду параметров, важных для тех областей практического применения, в которых необходима точная перенастраиваемая люминесценция.
Преимущества квантовых точек:
- Фотостабильны, сохраняют флуоресцентные свойства в течение нескольких лет.
- Высокая стойкость к фотовыцветанию: в 100 – 1000 раз выше, чем у органических флуорофоров.
- Высоких квантовый выход флуоресценции – до 90%.
- Широкий спектр возбуждения: от УФ до ИК (400 – 200 нм).
- Высокая чистота цвета из-за высоких пиков флуоресценции (25-40 нм).
- Высокая устойчивость к химической деградации.
Еще одним преимуществом, в особенности для полиграфии, является то, что на основе квантовых точек можно делать золи – высокодисперсные коллоидные системы с жидкой средой, в которой распределены мелкие частицы. А значит из них можно производить растворы, пригодные для струйной печати.
Области применения квантовых точек:
Защита документов и изделий от фальсификации: ценных бумаг, банкнот, удостоверений личности, штампов, печатей, сертификатов, свидетельств, пластиковых карт, товарных знаков. Система многоцветного кодирования на основе квантовых точек может быть коммерчески востребована для цветовой маркировки продукции в пищевой, фармацевтической, химической промышленности, ювелирных изделий, произведений искусства.
Благодаря тому, что жидкая основа может быть водной или уф-отверждаемой, при помощи чернил с квантовыми точками можно маркировать практически любые объекты – для бумажных и других впитывающих основ - чернила на водной основе, а для невпитывающих (стекло, дерево, металл, синтетические полимеры, композиты) – уф-чернила.
Маркер в медицинских и биологических исследованиях. Благодаря тому, что на поверхность квантовых точек можно нанести биологические маркеры, фрагменты ДНК и РНК, реагирующие на определенный тип клеток, их можно использовать в качестве контраста в биологических исследованиях и диагностике рака на ранних стадиях, когда опухоль еще не определяется стандартными методами диагностики.
Использование квантовых точек в качестве флуоресцентных меток для изучения опухолевых клеток invitro– одна из наиболее перспективных и быстро развивающихся сфер применения квантовых точек в биомедицине.
Массовому внедрению этой технологии препятствует только лишь вопрос о безопасности применения контрастов с квантовыми точками в исследованиях invivo, так как большая часть из них производится из очень токсичных материалов, а размеры настолько малы, что они с легкостью проникают через любые барьеры организма.
Дисплеи на квантовых точках: QLED – технология создания дисплеев LCDсо светодиодной подсветкой на квантовых точках уже опробована передовыми производителями электроники. Применение этой технологии позволяет сократить энергопотребление дисплея, увеличить световой поток по сравнению с LED экранами на 25-30%, более сочные цвета, четкая цветопередача, глубина цвета, возможность делать экраны сверхтонкими и гибкими.
Прототип первого дисплея, по этой технологии был представлен компанией Samsungв феврале 2011, а первый компьютерный дисплей выпустила компания Philips.
В нем квантовые точки использованы для получения красного и зеленого цветов из спектра излучения синих светодиодов, что обеспечило близкую к естественной цветопередачу. В 2013 году компания Sony выпустила QLED экран, работающий по такому же принципу. В текущий момент эта технология производства больших экранов не имеет широкого применения из-за высокой себестоимости производства.
Лазер на квантовых точках. Лазер, рабочей средой которого являются квантовые точки в излучающей области, имеет ряд преимуществ в сравнении с традиционными полупроводниковыми лазерами на основе квантовых ям. У них лучше характеристики по полосе частот, интенсивности шума, они менее чувствительны к изменениям температуры.
Благодаря тому, что изменение состава и размера квантовой точки позволяет управлять активной средой такого лазера, стала возможна работа на длинах волн, которые раньше были недоступны. Эта технология активно применяется на практике в медицине, с ее помощью был создан лазерный скальпель.
Энергетика
На основе квантовых точек также разработаны несколько моделей тонкопленочных солнечных батарей. В их основе лежит следующий принцип действия: фотоны света попадают на фотоэлектрический материал, содержащий квантовые точки, стимулируют появление пары электрона и дырки, энергия которых равна или превосходит минимальную энергию, необходимую электрону данного полупроводника для того, чтобы перейти из связанного состояния в свободное. Изменяя размеры нанокристаллов материала можно варьировать «энергетическую производительность» фотоэлектрического материала.
На основе этого принципа уже создано несколько оригинальных работающих прототипов различных видов солнечных батарей.
В 2011 г. исследователи из университета Нотр-Дама предложили «солнечную краску» на основе диоксида титана, нанесение которой может превратить любой объект в солнечную батарею. У нее довольно низкое КПД (всего 1%), но зато она дешева в производстве и может производиться в больших объемах.
В 2014 г. Ученые из Массачусетского технологического института представили метод изготовления солнечных элементов из ультратонких слоёв квантовых точек, КПД их разработки – 9%, а главное ноу-хау заключается в технологии объединения квантовых точек в пленку.
В 2015 г. Лаборатория Центра передовых технологий солнечной фотовольтаики в Лос-Аламосе предложила свой проект окон-солнечных батарей с КПД 3,2%, состоящих из прозрачного люминесцентного квантового концентратора, который может занимать достаточно большую площадь, и компактных солнечных фотоэлементов.
А вот исследователи из американской национальной лаборатории возобновляемых источников энергии (NREL) в поисках оптимального сочетания металлов для производства ячейки с максимальной квантовой эффективностью создали настоящего рекордсмена производительности – внутренняя и внешняя квантовая эффективность их батареи на тестах составила 114% и 130% соответственно.
Эти параметры не являются КПД батареи, которая сейчас показывает сравнительно небольшой процент – всего 4,5%, однако оптимизация сбора фотопотока и не являлась ключевой целью исследования, которая заключалась только в подборе наиболее эффективного сочетания элементов. Тем не менее стоит отметить, что до эксперимента NREL ни одна батарея не показывала квантовую эффективность выше 100%.
Как видим потенциально сферы практического применения квантовых точек широки и разнообразны, теоретические разработки ведутся сразу в нескольких направлениях. Массовому внедрению их в различных сферах препятствует ряд ограничений: дороговизна производства самих точек, их токсичность, несовершенство и экономическая нецелесообразность самой технологии производства.
В самом ближайшем будущем массовое распространение может получить система цветового кодирования и маркировки чернилами на основе квантовых точек. Понимая, что эта рыночная ниша пока не занята, но является перспективной и наукоемкой, компания IQDEMY в качестве одной из научно-исследовательских задач своей химической лаборатории (Новосибирск) определила разработку оптимальной рецептуры уф-отверждаемых чернил и чернил на водной основе, содержащие квантовые точки.
Первые полученные образцы печати впечатляют и открывают дальнейшие перспективы практического освоения этой технологии:
А.В. Федоров, А.В. Баранов | ||||||||||||
Ln[ K(τ ) ] | ||||||||||||
τ , пс | ||||||||||||
Рис. 4.32. a – логарифм огибающей сигнала когерентного контроля как функция взаимной задержки между импульсами для различных относительных вкладов лоренцева однородного и гауссова неоднородного уширений (r = 2 = ! ). Сплошная линия – чисто лоренцево однородное уширение с~ 2 = 21:25 мкэВ; штриховая линия –r =1/1; пунктирная линия –r =1/2.5; штрихпунктирная –r =1/14. Абсолютные значения2 и! выбирались таким способом, чтобы HWHM фотолюминесцентной линии одиночной квантовой точки сохранялась постоянной (21:25 мкэВ) в соответствии с работой . б – контур Фойгта фотолюминесцентной линии одиночной квантовой точки, вычисленный для тех же параметров, что и в случае a.
измерительного прибора и подгонку контуром Фойгта. Это приводит к дополнительным ошибкам. На рис. 4.32 б построены формы линий фотолюминесценции одиночной квантовой точки при тех же отношениях2 = ! , что и на рис.4.32 a. Видно, что наиболее информативная часть спектральных линий – их крылья, где трудно добиться хорошего отношения сигнал/шум. В то же время, соответствующие измененияK() наиболее отчетливы в области, где сигнал когерентного контроля может быть получен с достаточной точностью. Таким образом, метод когерентного контроля можно использовать для изучения эффектов флуктуации зарядового окружения в оптических и релаксационных процессах.
4.3. Применение квантовых точек
4.3.1. Лазеры на квантовых точках для волоконной связи
Развитие оптоволоконных телекоммуникаций привело к необходимости создания эффективных полупроводниковых лазеров и оптических усилителей, работающих в спектральной области минимальных потерь волноводов (1.25– 1.65 мкм). Наибольшая длина волны, достигнутая лазерами на квантовых ямах InGaAs/GaAs, составляет 1230 нм – для устройств, генерирующих с торца , и 1260 нм для лазеров с вертикальным резонатором . Достаточно большие пороговые токи, низкая рабочая температура и невысокая
4. Оптика квантовых точек |
температурная стабильность таких лазеров не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к высокоскоростным телекоммуникационным устройствам.
Прогресс в изготовлении многослойных структур самоорганизованных квантовых точек соединений A3 B5 , достаточно однородных по размеру и форме при большой поверхностной плотности, привел к созданию полупроводниковых лазеров с квантовыми точками в качестве активной среды . В результате спектральная область 1.0–1.7 мкм стала доступной для генерации как для лазеров традиционной конструкции , так и для лазеров с вертикальным резонатором , использующих квантовые точки InGaAs и подложки GaAs. В частности, оба типа лазеров могут генерировать излучение с длиной волны 1.3 мкм с чрезвычайно низкими пороговыми токами и высокой выходной мощностью . Недавно был продемонстрирован широкополосный лазер на квантовых точках, излучающий на 1.5 мкм с плотностью тока всего в 70 А/см2 на один слой квантовых точек при комнатной температуре . Оптические усилители на основе квантово-точечных структур представляют интерес для высокоскоростной обработки сигналов со скоростью свыше 40 Гбит/с . Существенно, что развитые GaAs-технологии позволяют изготавливать достаточно дешевые монолитные лазеры на квантовых точках с вертикальным резонатором c распределенными брегговскими зеркалами на основе пар AlAs/GaAs и AlOx /GaAs .
Следует отметить, что благодаря неоднородному уширению электронных переходов в квантовых точках возникает возможность расширения области непрерывной перестройки длины волны генерации. При некотором увеличении пороговых токов она может достигать 200 нм (1.033–1.234 мкм) .
Лазеры, использующие InAs-квантовые точки и InP-подложки, также представляют интерес, поскольку они позволяют получать генерацию в более длинноволновом диапазоне (1.8–2.3 мкм), важном для применений в молекулярной спектроскопии и дистанционном контроле газовых атмосфер с помощью лидаров. В то же время, генерация излучения с длиной волны 1.9 и 2 мкм лазера с активной средой из такой гетероструктуры была получена пока только при низкой (77 К) температуре. Интересно, что генерация на длинах волн 1.6 и 1.78 мкм была также продемонстрирована для лазеров на InAs квантовых проволоках – одномерных квантовых структурах на (001)InP-подложке. И наконец, непрерывная генерация в области 2 мкм получена при комнатной температуре при использовании в качестве активной среды лазера квантовых точек на основе InAsSb, выращенных на (001)InP-подложке .
Интенсивное развитие этого направления привело к тому, что в настоящее время некоторые типы полупроводниковых лазеров с активной средой на основе квантовых точек стали коммерчески доступны, .
260 А.В. Федоров, А.В. Баранов
4.3.2. Квантовые точки в биологии и медицине
Одной из наиболее активно развивающихся областей применения полупроводниковых квантовых точек является использование коллоидных квантовых точек (полупроводниковых нанокристаллов в органических и водных растворах) в качестве люминесцентных меток для визуализации структуры биологических объектов разного типа и для сверхчувствительного детектирования биохимических реакций, которые крайне важны в молекулярной и клеточной биологии, медицинской диагностике и терапии. Люминесцентная метка представляет собой люминофор, связанный с молекулой-линковщиком, которая может селективно связываться с детектируемой биоструктурой (мишенью). Метки должны быть растворимыми в воде, иметь большой коэффициент поглощения, обладать высоким квантовым выходом люминесценции в узкой спектральной полосе. Последнее особенно важно для регистрации многоцветных изображений, когда различные мишени в клетке помечены разными метками. В качестве люминофоров меток обычно используются органические красители. Их недостатками являются низкая устойчивость к фотообесцвечиванию, не позволяющая проводить долговременные измерения, необходимость использования нескольких источников света для возбуждения различных красителей, а также большая ширина и асимметрия полос люминесценции, затрудняющие анализ многоцветных изображений.
Последние достижения в области нанотехнологий позволяют говорить о создании нового класса люминесцентных меток, использующих в качестве люминофора полупроводниковые квантовые точки – коллоидные нанокристаллы .
Синтез нанокристаллов на основе соединений A2 B6 (CdSe, CdS, CdTe, ZnS) и A3 B5 (InP и GaAs) известен достаточно давно . Еще в 1993 году был предложен высокотемпературный органометаллический синтез квантовых точек CdSe и получены нанокристаллы с хорошей кристаллической структурой и узким распределением по размерам, но с квантовым выходом, не превышающим 10%. Резкое увеличение квантового выхода квантовых точек до 85% при комнатной температуре было достигнуто, когда нанокристаллы стали покрывать тонкой (1–2 монослоя) оболочкой из другого материала с большей шириной запрещенной зоны (например, для CdSe это ZnS, CdS, CdO) . Такие структуры называются квантовые точки ядро/оболочка (core/shell QDs). Диаметр квантовых точек (от 1.5 нм и выше) можно контролировать, варьируя время реакции, проходящей при температуре около 300o С, от минут до нескольких часов или просто отбирая необходимое количество продукта через разное время после начала реакции . В результате оказалось возможным получить набор квантовых точек одного состава, но с разными размерами. Например, положение полосы люминесценции CdSe/ZnS КТ может меняться в диапазоне от 433 до 650 нм (2.862– 1.906 эВ) при ширине полосы около 30 мэВ . Использование других материалов позволяет существенно расширить спектральную область перестройки полосы люминесценции нанокристаллов (рис.4.33 ). Существенно,
Оптика квантовых точек | |||||
Интенсивность | |||||
Длина волны, | |||||
Рис. 4.33. Спектры люминесценции полупроводниковых нанокристаллов различного состава и разных размеров. Сплошные линии соответствуют нанокристаллам CdSe c диаметрами 1.8, 3.0 и 6.0 нм, пунктирные – нанокристаллам InP c диаметрами 3.0 и 4.6 нм, штриховые – нанокристаллам InAs с размерами 2.8, 3.6, 4.6 и 6.0 нм.
что нанокристаллы демонстрируют более узкие и симметричные полосы люминесценции, чем обычные органические красители. Это является чрезвычайно важным преимуществом при анализе многоцветных изображений. На рис. 4.34 в качестве примера сопоставлены спектры люминесценции нанокристаллов CdSe/ZnS и молекул родамина 6Ж.
Интенсивность, отн. ед.
Родамин 6 Ж |
Квантовые точки
Длина волны, нм
Рис. 4.34. Сопоставление полос люминесценции квантовых точек и молекул родамина 6Ж.
Дополнительным преимуществом является то, что нанокристаллы одного состава обычно имеют широкую полосу поглощения с высоким молярным коэффициентом экстинкции (до 10−6 см−1 М−1 ), соответствующую переходам в высокоэнергетические состояния. Ее положение слабо зависит от размера квантовой точки. Поэтому в отличие от красителей оказывается возможным
262 А.В. Федоров, А.В. Баранов
эффективное возбуждение люминесценции нанокристаллов разных размеров одним лазерным источником света. Однако основным преимуществом является то, что нанокристаллы имеют великолепную фотоустойчивость : они не выцветают в течение нескольких часов и даже дней, в то время как характерные времена фотообесцвечивания обычных люминофоров ограничены единицами минут (рис.4.35 AlexaFluor® 488Рис. 4.35. Фотоиндуцированная деградация люминесценции меток на основе CdSe/ZnS нанокристаллов CdSe/ZnS и традиционных молекулярных люминофоров под действием излучения ртутной лампы .
Поверхность таких квантовых точек, полученных в результате химической реакции, покрыта гидрофобными молекулами, используемыми при синтезе, поэтому они растворимы только в органических растворителях. Поскольку биологические объекты (протеины, ДНК, пептиды) существуют только в водных растворах, были разработаны методы модификации поверхности нанокристаллов, которые делают их водорастворимыми как с положительно, так и с отрицательно заряженной поверхностью. Предложены несколько типов молекул-линковщиков, позволяющих селективно связывать нанокристаллы с анализируемыми биомолекулами. В качестве примера, на рис.4.36 приведен пример нанокристалла CdSe, покрытого оболочкой из ZnS, который ковалентно связан с протеином молекулой меркаптоуксусной кислоты .
В самое последнее время люминесцентные метки на основе полупроводниковых квантовых точек для мишеней различного типа стали коммерчески доступными .
Для использования квантовых точек in vivo необходимо предпринять меры, уменьшающие их токсичность. В этих целях предложено помещать квантовые точки в инертные полимерные сферы с диаметрами 50–300 нм и уже их использовать в качестве люминофоров в случаях, когда относительно большие размеры наносфер не препятствуют их применению. Исполь-
«Очки профессора Панкова» - портативное устройство квантового восстановления и иридорефлексотерапии. Основное предназначение прибора - лечение и необходимая профилактика болезней глаз, внутренних органов, а также систем человеческого тела. Созданный проф. Панковым аппарат, широко применяют в условиях медицинских стационаров, амбулаториях, а также самостоятельно дома.
«Очки Панкова» будут полезны людям, чья рабочая деятельность неотделима от высокой нагрузки на орган зрения (работники офисов, научные сотрудники, менеджеры, программисты, педагоги, писатели, водители всех видов транспорта и пр.).
Технические характеристики
Прибор представляет собой очковую оправу, куда вмонтированы светодиодные излучатели, управляемые встроенными микропроцессорными контролерами. Блок питания устройства совмещен со светодиодными излучателями. Количество излучателей - 2 штуки. Длина волн излучения - 450, 530 и 650 нм. Исходящее излучение имеет импульсивно-периодический режим работы. Питание осуществляют 4 кнопочные батарейки (AG-13). Потребляемая мощность - до 0,1 Вт. Прибор имеет небольшой вес - примерно200 грамм.
Аппарат «Очки профессора Панкова» поставляется в следующем комплекте:
- Аппарат «Очки Панкова».
- Паспорт технический, инструкция по применению.
- Коробка упаковочная.
Принцип действия
Воздействие световыми импульсами на глаза, заставляет зрачки сужаться и расширяться рефлекторно, оказывая уникальное оздоровительное воздействие. Благодаря ему снимаются спазмы и, со временем увеличивается сила аккомодационной мышцы. Ритмичное сокращение глазных мышц под действием, устройства активизирует лимфодренаж, усиливая кровообращение органа зрения, улучшает микроциркуляцию в тканях глаза, включая сетчатку, что делает их питание полноценным и правильным. Кроме того, световое воздействие активизирует процесс нейронной передачи сигналов и их зрительное восприятие.
Действие прибора меняет диаметр зрачка, а вместе с этим меняется и положение радужки, результатом чего становится улучшение продвижения внутриглазной жидкости по путям оттока. Жидкость попадает в переднюю камеру обогащенной, насыщая её питательными веществами. Это улучшает питание переднего глазного отрезка (роговицу, радужку, хрусталик), что делает «Очки Панкова» практически незаменимыми при патологиях данных структур органа зрения.
Показания
- начальные степени катаракты;
- дистрофия сетчатки;
- глаукома;
- амблиопия, ;
- миопия (прогрессирующая );
- возрастная ;
- атрофия зрительного нерва;
- компьютерный синдром;
- период после офтальмологических операций.
Способ применения
Сеансы с аппаратом необходимо проводить лежа или сидя. До начала стоит сделать несложное дыхательное упражнение (глубокие вдохи и выдохи).
Нельзя проводить сеансы при просмотре телевизора, а также непосредственно перед сном. Не рекомендуется применять прибор в состоянии раздражения, повышенной нервозности.
Время сеанса квантового воздействия составляет пятнадцать минут ежедневно.
Первый сеанс должен начаться с закрытыми глазами (как и каждый последующий) и продолжаться до трех минут, что необходимо для того, чтобы интенсивность воздействия увеличивалась постепенно. Каждый последующий сеанс продлевают на 3 минуты. Максимально возможное время воздействия- 15 минут. Курс лечения предусматривает 15 сеансов. Его можно повторить не ранее, чем через месяц.
В случае синдрома усталости глаз, сеансы нужно поводить по мере необходимости по три минуты (ежедневно) перед началом работы, которая вызывает переутомление глаз, так же как и после неё.
Результат применения прибора будет намного лучше, если использовать «Очки Панкова» одновременно с витаминами для глаз в капсулах (Лютеин Комплекс либо Антоциан Форте), а также витаминными каплями (Тауфон, Квинакс и пр.).
Прерывать сеансы более, чем на три дня не рекомендуется.
Противопоказания к использованию очков
- воспаления глаз в острой фазе;
- сетчатки;
- беременность;
- новообразования мозга и глаз;
- период после трансплантации;
- возраст до трех лет;
- расстройства психики хронического характера;
- некомпенсированный сахарный диабет;
- гипотония;
- инсульт.
Цена прибора, где купить
Любое вещество микроскопического размера — это наночастица, материал, используемый исследователями нанотехнологий для разработки и создания новых технологий, основанных на применении элементов в этой крошечной форме. Читаем внимательно, потому что надо будет немного вникнуть в суть текста.
Квантовые точки — это наночастицы, изготовленные из любого полупроводникового материала, такого как кремний, селенид кадмия, сульфид кадмия или арсенид индия, которые светятся определенным цветом после освещения светом.
Цвет, которым они светятся, зависит от размера наночастицы. Путем размещения квантов разного размера можно добиться наличия красного , зеленого и синего цвета в каждом пикселе экрана дисплея, что даст возможность создания полного спектра цветов в этих пикселях (любой существующий цвет получается путем смешивания этих цветов).
Когда квантовые точки освещаются УФ светом, некоторые из электронов получают достаточную энергию, чтобы освободиться от атомов. Эта способность позволяет им перемещаться вокруг наночастицы, создавая зону проводимости, в которой электроны могут свободно перемещаться по материалу и проводить электричество.
Когда электроны опускаются на внешнюю орбиту вокруг атома (валентной зоны), они испускают свет. Цвет этого света зависит от разности энергий между зоной проводимости и валентной зоной.
Чем меньше наночастица, тем выше разность энергий между валентной зоной и зоной проводимости, что приводит к более глубокому синему цвету. Для большей наночастицы разница в энергии между валентной зоной и зоной проводимости ниже, что смещает свечение в сторону красного .
Квантовые точки и дисплеи
Для ЖК-дисплеев преимущества многочисленны. Давайте рассмотрим самые важные и интересные особенности, которые получили ЖК-экраны от квантовых точек.
Более высокая пиковая яркость
Одной из причин, по которой производители так «млеют» от квантовых точек — это возможность создавать экраны с гораздо большей пиковой яркостью, чем при использовании других технологий. В свою очередь, повышенная пиковая яркость дает гораздо большие возможности для использования HDR и Dolby Vision.
Dolby Vision — это стандарт видеоизображения, который имеет расширенный динамический диапазон, то есть очень большую разницу света между самой яркой и самой темной точкой на экране, что делает изображение более реалистичным и контрастным.
Если вы не в курсе, то разработчики постоянно пытаются сыграть Господа Бога и создать то, что создал он (ну или кто там все это создал вокруг нас, может быть вселенная?), только перенести это на экран.
То есть, например, обычное небо в ясный день имеет яркость примерно 20000 нит (ед. измерения яркости), в то время как лучшие телевизоры могут предоставить яркость около 10 меньше. Так вот, стандарт Dolby Vision пока впереди планеты всей, но до Создателя им еще очень далеко:)
Соответственно, экраны на квантовых точках — это еще один шаг к более яркому изображению. Возможно мы когда-нибудь сможем увидеть практически настоящий рассвет и/или закат, а может и другие неповторимые чудеса природы, не выходя из дома.
Лучшая цветопередача
Еще одно большое преимущество квантовых точек — улучшение цветовой точности. Так как в каждом пикселе есть КТ красного, синего и зеленого цвета, это дает возможность получить доступ к полной палитре цветов, что, в свою очередь, позволяет добиться невероятного количества оттенков любого цвета.
Улучшенное время автономной работы мобильных устройств
Экраны на квантовых точках обещают иметь не только превосходного качества изображения, но и обладать исключительно низким энергопотреблением.
Квантовые точки и Samsung QLED
Телевизоры на квантовых точках от Samsung, или просто , на самом деле не совсем на квантовых точках в правильном понимании этой технологии. QLED — это скорее гибрид, что-то среднее между квантовыми точками и экранами LED. Почему? Потому, что в этих телевизорах до сих пор используется светодиодная подсветка, а в настоящем экране на квантовых точках свет должен создаваться именно точками.
Поэтому, пусть даже новые телевизоры от южнокорейского гиганта и показывают лучше, чем обычные LED-экраны, они все же не телевизоры на квантовых точках, а телевизоры с квантовыми точками вместо светофильтра.
Комментарии:
| Иван Иванович |
Loading...